亲爱的小伙伴们，相信很多人对GM1神经节苷脂抗帕金森病的新机制:自噬和雷帕霉素mTOR 抑制剂浓度都不是特别了解，因此今天我来为大家分享一些关于GM1神经节苷脂抗帕金森病的新机制:自噬和雷帕霉素mTOR 抑制剂浓度的知识，希望能够帮助大家解决这些问题。

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GM1神经节苷脂抗帕金森病的新机制:自噬依赖性去除α-突触核蛋白

前言
帕金森病(PD)是最普遍的神经退行性疾病之一，影响2%-3%的65岁及以上人群。一般来说，PD的特征是中脑黑质中多巴胺能神经元的选择性缺失。研究人员已经报道了PD的多种分子机制，如线粒体功能障碍、氧化应激、轴突运输、Ca2+稳态和神经炎症。特别是，α-synuclein(α-Syn)（路易体的胞内成分）被认为是PD最重要的神经病理学特征之一。在PD患者的多巴胺能神经元、MPTP（四氢吡啶）处理的动物和MPP+（MPTP代谢物）处理的神经母细胞瘤细胞中观察到α-Syn的积累。此外，有研究报道，α-Syn突变(A30P、A53T和E46K)是罕见家族性PD的主要原因。
因此，清除α-Syn为帕金森病的治疗提供了一种合理的途径。自噬被认为在降解细胞内α-Syn聚集物中起着重要作用。Rapamycin（雷帕霉素）已被证明通过诱导自噬减少α-Syn聚集，从而在体内和体外保护多巴胺能神经元抵抗死亡。不幸的是，Rapamycin缺乏特异性，常常导致口腔和呼吸道感染、白细胞减少、口腔炎、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、免疫抑制等多种副作用，从而限制了Rapamycin在PD治疗中的应用。因此，目前迫切需要寻找其他能够清除α-Syn聚集物但副作用更少的PD候选治疗方法。
GM1神经节苷脂(18:1/18:0)是一种主要的脑神经节苷脂，由三个结构单元组成：一个低聚糖，一个神经酰胺锚点和几个唾液酸残基。由于其对神经元可塑性、神经营养物质的释放、神经传递以及与神经调节蛋白的相互作用的调节作用，这种分子被认为是各种大脑功能中必不可少的调节剂。外源性神经节苷脂已经被证明可以影响中枢神经系统中的多巴胺能、谷氨酸能和胆碱能神经元的存活。GM1神经节苷脂的治疗作用已在PD患者，以及MPTP治疗的小鼠和灵长类动物，显示神经保护或神经修复作用。尽管有这些积极的数据，但GM1神经节苷脂治疗PD的确切机制仍不确定。在以前的报道中，这种治疗方法被猜测以自噬依赖的方式降解α-Syn，这促使作者研究自噬是否参与GM1神经节苷脂的抗PD机制。
研究结果
1.GM1神经节苷脂改善了C57BL/6J小鼠MPTP诱导的行为缺陷，并恢复了多巴胺及其代谢产物的水平
MPTP被酶MAO-B转化为毒性代谢物MPP+，通过抑制线粒体电子传递链复合物I杀死多巴胺能神经元。因此，MPTP和MPP+通常分别在体内和体外诱导一种与PD相似的神经元细胞毒性综合征。在本研究中，C57BL/6J小鼠腹腔注射MPTP(30mg/kg)5天建立PD模型，以评估GM1神经节苷脂的保护作用。治疗2周后，进行行为测试，包括爬杆测试、旋转测试和步态分析。如（图1a）所示，MPTP处理的小鼠比对照组小鼠花更多的时间爬杆。相比之下，GM1神经节苷脂（静脉注射，25和50mg/k）和selegiline（司来吉林MAO-B抑制剂，静脉注射，60mg/kg）显著减少MPTP治疗的小鼠爬杆时间。在旋转测试中，MPTP处理显著降低了下降潜伏期，为MPTP所致的运动功能障碍。GM1神经节苷脂和selegiline可抑制MPTP诱导的下降潜伏期的下降（图1b）。
作者进一步评估了GM1神经节苷脂对步态的治疗作用，通过包括步速、摆动速度、步频、跑步持续时间和步行速度等参数的猫步试验。如（图1c-g）所示，MPTP处理小鼠的摆动速度和步频显著下降，而在步数周期、跑步持续时间和步行速度上，则观察到显著增加。相比而言，GM1神经节苷和selegiline的治疗有效改善了MPTP引起的这些步态行为障碍(图1c-g)。此外，GM1神经节苷治疗恢复了步态表现(图1k)。在MPTP处理的小鼠中，增加了四肢的触摸和悬挂次数(图1l)，和步法模式的数量(图1m)。这些行为测试提示GM1神经节苷脂对PD有明显的治疗作用。值得注意的是，GM1神经节苷脂在三个行为测试中的保护作用被3-MA（自噬抑制剂）逆转（图1a-g和k-m）。这一发现表明，GM1神经节苷脂的保护作用可能与自噬有关。
此外，采用高效液相色谱-电化学检测小鼠纹状体中多巴胺及其代谢产物的水平。如（图1h-j）所示，MPTP处理显著降低了多巴胺、二羟基苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)的水平。GM1神经节苷脂和selegiline治疗可防止MPTP诱导的多巴胺、DOPAC和HVA水平减少，提示GM1神经节苷脂能有效改善多巴胺能神经元的功能。
2.GM1神经节苷脂改善MPP+诱导的神经毒性，减少神经元细胞中α-Syn的积累
MPTP的代谢物MPP+在体外可导致神经毒性。因此，作者进一步利用MPP+验证GM1神经节苷脂对SH-SY5Y细胞的神经保护作用。如（图2a）所示，GM1神经节苷脂浓度小于320μM时不引起任何细胞毒性。MPP+（1mM）显著抑制细胞增殖，而不同浓度的GM1神经节苷脂（20、40和80μM）处理可显著减弱MPP+诱导的细胞增殖抑制（图2b）。此外，MPP+导致细胞形态发生明显变化，伪足减少，胞体拉长，GM1神经节苷脂使其恢复（图2c）。Westernblot分析显示，GM1神经节苷脂处理显著抑制MPP+诱导的SH-SY5Y细胞钟α-Syn积累（图2d）。同样，GM1神经节苷脂以时间依赖性的方式降低了PC12α-SynA53T细胞中的α-Syn过表达作用（图2e）。
线粒体功能缺陷和氧化应激已在PD的发病机制中得到证实。如（图2g和h）所示，1mMMPP+处理SH-SY5Y细胞36h后，线粒体膜电位(δψm)明显降低，ROS水平升高，而GM1神经节苷脂治疗明显抑制了这些变化。此外，自噬抑制剂（3-MA或bafilomycinA1）可消除GM1神经节苷脂的治疗效果。这些体外研究结果与MPTP处理的小鼠的观察结果一致，进一步提示自噬激活参与了GM1神经节苷脂对PD的保护作用。
3.GM1神经节苷脂诱导神经元细胞自噬
已有研究报道GM1神经节苷脂可诱导促进多种细胞系自噬。体外实验显示，不同剂量的GM1神经节苷脂处理SH-SY5Y细胞后，自噬标记物LC3-II增加和自噬底物SQSTM1/p62的降解均增强，特别是在40μM（图3a）。另外，在该剂量下，GM1神经节苷脂对细胞处理24h后，这些自噬相关蛋白的影响最为明显（图3b）。为更直观的观察GM1神经节苷脂对细胞自噬的促进作用，作者使用mRFP-GFP-LC3标记进行自噬通量测定。Rapamycin（雷帕霉素）通过抑制mTOR发挥自噬诱导作用，作为阳性对照。由于GFP对低pH条件敏感，当自噬小体与溶酶体融合时，GFP(绿色)荧光被熄灭，只能观察到mRF（红色）荧光。当GFP和mRFP（黄色）荧光同时出现时，说明自噬小体不与溶酶体结合。与对照组相比，GM1神经节苷脂和Rapamycin处理的细胞中红色斑点明显增多，而GM1神经节苷脂和bafilomycinA1联合处理可增强黄色斑点（图3c），说明GM1神经节苷脂增强了SHSY5Y细胞的自噬通量。
4.GM1神经节苷脂激活自噬有助于清除α-Syn
由于去除异常的α-Syn为PD的治疗提供了一个很有潜力的策略，早期研究表明自噬介导的α-Syn降解有利于对PD的保护作用。GM1神经节苷脂对MPTP诱导的小鼠及MPP+诱导的细胞的保护作用被3-MA和bafilomycinA1阻断，说明可能与自噬激活有关。如预期的那样，3-MA显著消除了GM1神经节苷脂对MPP+处理SH-SY5Y细胞中α-Syn蛋白水平的影响（图4a）。作者随后进一步确定GM1神经节苷脂对自噬过程的影响。数据显示，MPP+存在下，GM1神经节苷脂处理明显促进了SH-SY5Y细胞中LC3-I向LC3-II的转化，同时自噬底物SQSTM1/p62蛋白水平下降（图4b）。此外，透射电镜显示，GM1神经节苷脂处理小鼠的黑质中存在明显的自噬泡（图4c）。重要的是，共聚焦显微镜图像显示GM1神经节苷脂诱导的自噬小体与MPP+诱导的α-Syn共定位（图4d）。这些体内和体外数据表明，GM1神经节苷脂激活自噬，参与α-Syn清除。
此外，作者使用doxycycline诱导α-SynA53T表达的PC12α-SynA53T细胞，验证GM1神经节苷脂对自噬和α-Syn清除的影响。共聚焦显微镜结果（图5a）显示，在PC12α-SynA53T细胞中，GM1神经节苷脂处理后LC3斑点增加，而doxycycline诱导的α-Syn积累减少，其中LC3和α-Syn的共定位显著增强（图5a）。Westernblot分析证实，GM1神经节苷脂导致α-Syn蛋白水平下降，而3-MA共处理逆转了这一趋势（图5b）。与GM1神经节苷脂类似，Rapamycin也能强烈降低α-Syn水平（图5b）。作者采用化学反应方法，用荧光FITC荧光标记GM1神经节苷脂。在受GM1-FITC处理的PC12α-SynA53T细胞中观察到强烈的绿色荧光（图5c）。同时，在PC12α-SynA53T细胞中，GM1-FITC和α-Syn以及GM1-FITC和LC3之间观察到明显的共定位（图5d）。综上所述，这些数据表明GM1神经节苷脂激活自噬来清除α-Syn的积累。
5.ATG13-ULK1复合物参与GM1神经节苷脂诱导的自噬
ULK复合体由ULK1、ATG13、FIP200和ATG101组成，它们是启动自噬过程所必需的。作者评估了GM1神经节苷脂对ULK1和ATG13蛋白表达水平的影响。值得注意的是，GM1神经节苷脂处理促进了PC12α-SynA53T细胞中ATG13和ULK1的磷酸化（图6a）。然而，GM1神经节苷脂的作用被3-MA抑制（图6a）。同样，GM1神经节苷脂处理的SH-SY5Y细胞也显示出p-ATG13/ATG13的比例增加，而3-MA处理抑制了GM1神经节苷脂的这种作用（图6b）。综上所述，GM1神经节苷脂通过激活ATG13-ULK1复合物来诱导自噬。
总结
总的来说，作者通过MPTP/MPP+处理建立了α-Syn过表达模型，以评估GM1在体内和体外对PD的治疗作用。此外，使用表达诱导型α-Syn的PC12α-SynA53T细胞来证明GM1和α-Syn之间的直接关系。研究结果表明，自噬的激活解释了GM1神经节苷脂的抗PD作用，并为GM1神经节苷脂清除α-Syn的机制提供了可能的理论基础。

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雷帕霉素mTOR 抑制剂浓度

最近关于雷帕霉素的问题蛮多的；下面简单说一下它：

雷帕霉素是一种有效的特异mTOR抑制剂，在HEK293细胞中的IC50为0.1nM。雷帕霉素与FKBP12结合，并特异性地充当mTORC1的变构抑制剂。雷帕霉素是一种自噬激活剂，一种免疫抑制剂

雷帕霉素的体外

雷帕霉素（12.5-100nM;24小时）处理在所有测试的细胞系（A549，SPC-A-1、95D和NCI-H446细胞）中以剂量依赖性方式对肺癌细胞增殖产生适度的抑制作用

雷帕霉素的体内

单独使用雷帕霉素（2.0mg/kg；腹膜内注射；隔日一次；28天）具有中等抑制作用。然而，与对照组，雷帕霉素单药治疗组和二甲双胍单药治疗组相比

以上是关于雷帕霉素的简单的介绍和部分的生物活性的内容，希望给到你帮助···

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细胞自噬

自噬（autophagy）被认为是维持细胞稳态的关键过程，也是对等压力源的反应，如营养缺乏，这可能会危及细胞的生存。当细胞接触到这些压力源时，原本在低水平发生以平衡生物分子的恒定合成的自噬，就会被大幅度上调。这种上调会增加了细胞的吸收和降解，将大分子释放回胞质中以驱动必须的代谢反应并产生能量。

在正常和压力条件下，自噬对细胞健康的贡献，意味着这种严格调控和精确协调过程的重要生理和病理作用。事实上，自噬在哺乳动物的发育过程中被发现是有用的。此外，最近的研究发现自噬是各种疾病和病症的重要调节器。探索自噬在发育和疾病中的参与，对于更全面地了解这一途径的作用至关重要，并且可能对保持健康或治疗疾病有影响。

自噬的研究已经成为如今医学研究的常客，发文量也十分巨大，成为常规生物学现象来研究，但是有一些实验上的技巧值得探讨一二，例如一些试剂的使用等等

1、自噬相关试剂的使用。

①MDC:取12mg粉末溶于720nlDMSO使其浓度为50mmol/L,分装后-20冰箱保存。临用前用MEM稀释到终浓度50umol/L;

②Rapamycin:用MEM培养基配成终浓度为1umol/L,现用现配;

400ng/ml喹乙醇:称取4mg喹乙醇,DMSO预溶(体积《0.1%)后加入10mlMEM培养液至完全溶解,现用现配,避光保存;

③3-MA:首先用PBS溶解粉末,临用前加热至完全溶解后再加入MEM培养基至终浓度10mmol/L;PI3K抑制剂（3-MA，Wortmannin）可干扰或阻断自噬体的形成；

用RAPAMYCIN诱导自噬我也查过一部分文献，有用无血清的，也有用，一般培养基的，浓度从25nM到100nM都有，用的是50nM的雷帕霉素，加入一般的培养基中，目的是排除无血清所诱导出来的自噬。

文献说饥饿初期激活的是大分子自噬，在4-6小时活力达到最大，24h后以CMA途径为主

④Earle’sbalancedsaltssolution(EBSS)for48h

sigma的EBSS，货号E2888，有碳酸氢钠，有酚红的，酚红到不是很必须，只是一个PH指示作用，好看些

⑤无血清诱导自噬：EBSS诱导6个小时就可以了。

EBSS一定可以诱导出来，只是需要说明的是时间点的设置，因为从饥饿诱导开始半个小时就可能开始自噬了，一直到24小时都持续，所以应该设置不同的时间点观察这个作用。另外一个很大的问题是，饥饿诱导的一个很大的弊端是细胞死亡，这也是我面临的问题，就是在细胞收养的时候蛋白浓度太小了。24小时就很少了，更不要说48小时和72小时了。

⑥Hank’s诱导，也就是通常所说的饥饿诱导，细胞培养到对数生长期后以Hank’s替代常规完全培养基，3h后就可诱导出自噬。我用Hank’s诱导了3h后电镜观察有30%细胞都有自噬这种现象，但不如国外报道的高。

⑦sigma的氯喹的货号C6628。用氯喹做自噬抑制剂，293T细胞50uM就可以。1.可以用双蒸水配制2.配制后4度保存

不同的自噬抑制剂机制不同。抑制的步骤也不同。有的不能抑制lc3的剪切，但能抑制后续的步骤，Chloroquine抑制自噬体与溶酶体的融合过程，autophgy不能完成，所以lc3才会累积。因此加了抑制剂lc3之后会比不加的要高。氯喹能提高溶酶体中的pH值，使溶酶体中的酸性水解酶丧失活性，从而导致“自噬溶酶体”不能降解，因此，位于自噬体和自噬溶酶体膜上的LC3不能按时降解，表现为LC3荧光长时间的保留或WB中LC3条带变粗。

⑧Z-VAD-FMK（caspase-3抑制剂）抑制EV71感染所引起的细胞凋亡，观察细胞的自噬情况。研究发现，抑制细胞凋亡能增加LC3-I转化为LC3-II以及p62的降解。

1.雷帕霉素：作为以mTOR为靶点最经典的诱导剂已经被广为应用，推荐工作浓度为1μmol-10μmol；

2.氯喹：氯喹（Chloroquine）作为溶酶体的抑制剂，可以抑制自噬体与溶酶体的融合从而可以用来作为自噬以及自噬流的抑制剂用于实验研究，推荐使用浓度：10umol-50umol。

2、自噬诱导剂

正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的药物有：

(1)BredeldinA/Thapsigargin/Tunicamycin：模拟内质网应激

(2)Carbamazepine/L-690，330/LithiumChloride（氯化锂）：IMPase抑制剂（即Inositolmonophosphatase，肌醇单磷酸酶）

(3)Earle’s平衡盐溶液：制造饥饿

(4)N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：ClassIPI3KPathway抑制剂

(5)Rapamycin：mTOR抑制剂

(6)XestosponginB/C：IP3R阻滞剂

3、自噬抑制剂

(1)3-Methyladenine（3-MA）：（ClassIIIPI3K）hVps34抑制剂

(2)BafilomycinA1：质子泵抑制剂

(3)Hydroxychloroquine（羟氯喹）：Lysosomallumenalkalizer（溶酶体腔碱化剂）

衣霉素(tunicamycinfromSlreptomycessp.,TM).Sigma-Aldrich公司产品,货号:T7765;溶于DMSO中配成储存液,使用时DMSO终体积浓度不超过1/1000。

3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA).Sigma-Aldrich公司产品,货号:M9281;溶于灭菌超纯水制成储存液。

氯喹二磷酸盐(chloroquinediphosphatesalt,CQ)sigma-Aldrich公司产品,货号:C6628;溶于灭菌超纯水中制成存液。

雷帕霉素(rapamycin),2.5mg/mlinDMSO,Sigma-Aldrich公司产品,货号:R8781;

4、MDC染色焚光显微镜检测细胞自睡

单丹黄酰尸胺(Monodansylcadaverine,MDC)是一种突光染料,被用作自吞泡的示踪剂。具体操作步骤如下:

(1)将处于对数生长期的HepG2细胞按常规方法消化后接种于6孔板,每孔接种1x106个细胞;

(2)细胞密度达到60%-70%时,弃去培养液,小心用PBS洗1遍,分别用含TG浓度为0、0.5、1nM的培养基及含Rapamycin(终浓度1pM)的培养基继续培养24h;

(3)弃上清PBS洗2遍,每孔加入含MDC(终浓度50nM)的培养基于37V、5%CCh的恒温培养箱中避光温育20min;

(4)取出六孔板置于劳光显微镜下,Ih内观察细胞自唾发生情况并拍照。

5、流式细胞术检测细胞自噬发生率

(1)取对数生长期的HepG2细胞,接种于6孔板,培养24h之后,分别用含TG浓度为0、1、2、4、8uM的培养基继续培养24h和0.5uM的TG作用不同时间(0、24、36、48、60h)后,取出六孔板,将上清收集到4ml的离心管中;

(2)每孔加入2ml含MDC(终浓度50nM)的MEM培养基,于37°C、5%0?的恒温培养箱中避光孵育30min;

(3)将收集的上清2000rpm,离心5min;

(4)弃掉上清,每管加入500ul含MDC(终浓度50uM)的MEM培养基,吹打混句,37°C避光解育30min;

(5)取出六孔板,PBS洗2次,0.25%的胰酶消化2min,1ml的PBS吹打混匀收集到1.5ml的离心管中,2000rpm.离心5min;

(6)弃掉上清,加1ml的PBS重悬,2000rpm,离心5min;

(7)吸出800ul上清,剩余的200ul吹打混勾;

(8)鲜育完的上清,2000rpm,离心5min;

(9)弃掉上清,1ml的PBS吹打混勾收集到1.5ml的离心管中,2000rpm,离心5min;

(10)重复步骤(6)和(7);

(11)将上述两个相同浓度或相同时间点的两管混勾,过300目铜网上机检测。流式细胞

仪以488nm激发波长测定MDC染色的荧光强度。

LC3BWB:1:2000

条件是15%SDS-PAGE,正常跑胶至下沿0.5cm即可，200mA湿转45min正常0.45的PVDF，5%牛奶封闭1h，4C过夜摇动孵育，洗抗体3*5min即可

LC3B的Western-blot检测，配置的15%的分离胶，湿转250mA，60min

转自科研者言公众号
基金知识##细胞自噬的相关实验和方法，对实验很有用

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雷帕霉素的作用机理

雷帕霉素通过不同的细胞因子受体阻断信号传导，阻断T淋巴细胞及其他细胞由G1期至S期的进程，雷帕霉素可阻断T淋巴细胞和B淋巴细胞的钙依赖性和非钙依赖性的信号传导通路。雷帕霉素和FK506一样，结合在相同的免疫亲和蛋白（immunophilin）FKBP12上，形成RAPA-FKBP12复合物，这种复合物不能与钙调素结合，并且雷帕霉素亦不抑制T细胞的早期激活或直接减少细胞因子的合成。这种复合物的靶蛋白最早是在酵母菌中被确定，称为TOR1和TOR2。
最新研究发现，雷帕霉素（rapamycin）是一种有效的自噬诱导剂，通过诱导自噬从而减轻炎症反应，可能是其发挥免疫抑制的机制之一。

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71岁日本学者获2016诺贝尔生理学医学奖，为什么是他

今天下午，2016年医学界最受关注奖项——诺贝尔生理学或医学奖公布，71岁的日本科学家大隅良典（YoshinoriOhsumi）因其发现细胞自噬机制获奖，而这是细胞自噬领域第二次获此殊荣。而大隅良典教授接到获奖通知时非常惊讶，他还在东京工业大学的实验室进行研究。
那什么是细胞自噬？它和临床医学又有什么关系？
细胞自噬——不是细胞自杀，而是破釜沉舟
细胞自噬（Autophagy），是细胞在自噬相关基因(Atg)的调控下利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程，也就是“自己吃自己”（Self-Eating）。这是真核生物中对细胞内物质进行周转的一种进化上保守的重要过程，其实这就是存在于真核生物中一种高度保守的代谢过程，参与了调节细胞物质的合成，降解和重新利用之间的代谢平衡，影响到了生物生命过程的方方面面。
细胞自噬根据发生过程，分为大自噬（Macroautophagy），溶酶体主动并直接吞噬胞浆成分的微自噬（Microautophagy）以及分子伴侣介导的自噬（CMA），一般情况都指大自噬。
细胞自噬的过程如下：
1）细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体“样的膜结构，然后不断扩张，被称为“吞噬泡（Phagophore）”。
2）吞噬泡不断延伸，将胞浆中的任何成分，全部揽入，然后“收口“，成为密闭的球状的“自噬体（Autophagosome）”。
3）自噬体形成后，可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合（这种情况不是必然要发生的）。
4）自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体（Autophagolysosome），期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，两者的内容物合为一体，自噬体中的“货物“也被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。
这个过程是细胞在面对短暂生存压力时采取的措施，降解非必需成分养活自己，或者分解潜在毒性蛋白避免细胞损害。可以说这种极端的方式绝对是一种破釜沉舟——不成功便成仁。
细胞自噬对临床医学的贡献
说了这么多都是基础医学的研究进展，医生们更关心的是，这个领域在临床医学有何作为。
细胞自噬在机体的免疫、感染、炎症、肿瘤、心血管病、神经退行性病的发病中具有十分重要的作用。目前研究最热的三类疾病是肿瘤、神经退行性疾病和免疫性疾病。其中在肿瘤的作用争论最大，主要表现自噬基因敲除的动物自发肿瘤增多，相反自噬基因敲除后，增加了化疗、放疗、免疫治疗的敏感性。
作为免疫抑制剂的雷帕霉素因其自噬诱导性，现在被许多研究机构作为治疗帕金森病和阿尔茨海默病等神经退行性疾病的试验药物；而许多化妆品中含有的神经酰胺也是自噬诱导剂，因而具有所谓“抗衰老”作用。
另一方面，抑制胃癌、卵巢癌等恶性肿瘤增殖并增强其化疗敏感性的巴弗洛霉素A1就是自噬抑制剂；而临床上广泛治疗系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿性关节炎甚至最初被用来治疗疟疾的羟氯喹就具有自噬抑制性。
细胞自噬与诺奖的缘分
细胞自噬是现今生物学界的热门领域，而这也是细胞自噬领域第二次获得诺奖。第一次是在1974年，由这一领域的祖师爷，比利时科学家ChristiandeDuve因发现溶酶体获奖。而这位宗师级人物自己选择“安乐死”作为最终的归宿。
大隅良典的获奖可以说既出人意料又在意料之中。因为今年汤森路透是预测肿瘤免疫治疗领域获奖，而3年前预测的就是细胞自噬领域，其中大隅良典教授是获奖大热门。
在此之前，大隅良典教授因其成功克隆了第一个酵母自噬基因Atg1以及自噬特征蛋白LC3成为了该领域的泰斗。而今年他带领的研究团队发表论文成功探明了细胞自噬的启动机制，这或许是将他推上诺奖领奖台的“最终一击”。
不过有意思的是，当年在医学院学习细胞生物学时，细胞自噬似乎并不是考试重点。诺奖这一出估计会让不少学弟学妹们泪流满面。

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细胞自噬 与细胞活性之间的关系

细胞自噬是指在自噬相关基因的调控下，利用溶酶体降解自身受损的细胞器及大分子物质的过程，以此维持细胞自身的需要及细胞器的更新。
一、细胞自噬的基本概念及特征
1、自噬的过程
细胞质中的线粒体等细胞器首先被称为“隔离膜”的囊泡所包被,这种“隔离膜”主要来自于内质网和高尔基体;囊泡逐渐闭合最终形成双层膜结构,即自噬体，其大小约为500nm左右，囊泡内常见的包含物有胞质成分和某些细胞器如线粒体、内吞体、过氧化物酶体等;自噬体的外膜与溶酶体融合形成降解自体吞噬泡；由溶酶体内的酶降解自体吞噬泡中的内容物和内膜。
2、自噬的形态学变化
在电镜下能观察到高尔基体等细胞器膨胀，细胞核固缩，形成大量的吞噬泡，细胞质膜发生特化。
3、自噬的分类
①巨自噬（Macroautophagy）：最为常见，即上面说的自噬过程。
②微自噬（Microautophagy）：是指溶酶体主动、直接吞噬胞浆成分的一种方式。
③分子伴侣介导的自噬（CMA）：一些分子伴侣，如hsp70，能帮助未折叠蛋白转位入溶酶体。
4、影响因素
其影响因素包括：饥饿、蛋白聚集、凋亡、缺氧、病原体感染等，均会造成细胞自噬产生。正常情况下，细胞自噬发生的概率很低，只有受到以上因素的影响时，自噬才会被激活，参与机体稳态调控。
二、细胞自噬信号通路
自噬的调控
1、依赖mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶点）途径的自噬
1）PI3K-AKT-mTOR信号通路
2）AMPK-TSC1/2-mTOR信号通路
2、其它的信号通路
1）3-甲基腺嘌呤（3-MA）通过抑制ClassⅢPI3K的活性抑制自噬。
2）beclin1和UVRAG作为正调控子，抗凋亡因子bcl-2作为负调控子共同参与组成ClassⅢPI3复合物调控自噬。
3）GTP结合的G蛋白亚基Gαi3抑制自噬；GDP结合的Gαi3蛋白活化自噬。
4）死亡相关蛋白激酶（death-associatedproteinlinase,DAPK）和DAPK相关蛋白激酶（DAPK-relatedproteinkinase-1,DRP-1）诱导自噬。
三、细胞自噬的研究方法
1、自噬体的观察
直接法：直接在透射电镜下观察自噬不同阶段的形态变化
①初期，主要特征是成新月状，单层或多层膜
②中期：双层或多层的液泡状结构即自噬体结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网等
③后期：形成自噬溶酶体，单层膜，胞浆成分已降解。
间接法：
①RFP-GFP-LC3双荧光标记
②GFP-LC3单荧光标记
③MDC染色
2、自噬相关蛋白的研究
通过WesternBlot检测LC3II/I，p62，Beclin-1，ULK1蛋白的表达量
四、自噬研究进展
（1）细胞自噬与神经退行性疾病
YanYin，etal，AgeingResearchReviews，2017
YanYin等人研究发现，在神经退行性疾病例如阿尔茨海默病中，β-淀粉样蛋白在脑部的沉积可以抑制自噬体和溶酶体的融合，从而抑制自噬，导致神经细胞的死亡。
（2）细胞自噬与中药靶点研究
BingCui，etal，AsianNaturalproductsResearch，2017
BingCui，etal，AsianNaturalproductsResearch，2017
BingCui等人研究了多种中药成分在自噬调控中的作用，发现黄连素通过AMPK，抑制mTOR，进而促进细胞自噬；黄酮类药物主要与癌症相关，通过激活Beclin1，促进细胞自噬；多酚类药物在心血管疾病中应用较多，通过P38和LC3等靶点促进细胞自噬。
（3）细胞自噬与病原体感染
YanZhou，etal，Bbadis，2017
YanZhou，etal，Bbadis，2017
YanZhou等人研究发现，轮状病毒RVNSP4抑制IGF受体，阻断其与PI3K的结合，抑制了下游mTOR信号通路，解除了对ULK1的抑制作用，从而促进自噬，为病毒在宿主体内增殖提供条件。
（4）细胞自噬与免疫
SamuelDDowling，etal，CancerLett，2018
T细胞的激活与TCR信号通路和CD28信号通路有关，TCR信号通路和CD28信号通路的激活能促进IL-2的转录表达，IL-2与其受体结合，激活自噬相关通路，可以将错误折叠的蛋白和一些细胞器降解，为细胞生存提供条件。
（5）细胞自噬与肿瘤
细胞自噬与肿瘤的关系较为复杂，一方面，正常细胞自噬增强，可表现出抑制肿瘤发生的功能；另一方面，肿瘤细胞也可通过增强细胞自噬来对抗由缺氧、代谢产物、治疗药物诱导的应激反应。

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Ferroptosis: An Iron-Dependent Form of Nonapoptotic Cell Death

本文选自CELL，2012，铁死亡开山之作。
摘要：非凋亡形式的细胞死亡可能促进某些肿瘤细胞的选择性清除或在特定的病理状态下被激活。致癌的RAS选择性致死小分子Erastin触发了一种独特的铁依赖的非凋亡细胞死亡形式，我们称之为铁死亡。铁死亡依赖于细胞内的铁，而不依赖于其他金属，在形态、生化和基因上与凋亡、坏死和自噬不同。我们发现小分子铁抑素-1是一种有效的抑制癌细胞铁下垂和谷氨酸诱导的器官型大鼠脑片细胞死亡的抑制剂，提示这两个过程之间有相似之处。事实上，与谷氨酸一样，Erastin也能抑制胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白(系统x？)对胱氨酸的摄取，在细胞的抗氧化防御系统中造成空洞，最终导致铁依赖的氧化性死亡。因此，铁死亡的激活会导致某些癌细胞的非凋亡破坏，而抑制这一过程可能会保护生物体免受神经退化的影响。
首先作者研究的方向是非凋亡的死亡形式，其次，在针对RAS突变基因的药物筛选中找到了两个药物ERASTIN和RSL3，进一步探寻这两种药物作用机制以及对RAS基因突变的治疗效果。
RSL诱导的细胞死亡原因不明，涉及来自未知来源的ROS的积累和铁螯合作用对细胞死亡的抑制。我们观察到这两个过程是相互联系的。用RSL分子erastin(10mM)处理NRAS突变HT-1080纤维肉瘤细胞后，胞液和脂质ROS从2小时开始呈时间依赖性增加，这一结果通过分别使用荧光探针H2DCFDA和C11-BODIPY的流式细胞术检测到(图1B和图1C)。在细胞脱落和明显死亡之前，ROS的增加开始于6小时。与铁螯合剂去铁胺(DFO，100mM)共处理可以抑制ROS的积累和细胞死亡，而与三种不同的外源铁源孵育，但不与其他二价过渡金属离子(Cu2+，Mn2+，Ni2+和Co2+)孵育，则加强了Erastin诱导的死亡(图S1A和S1B可从网上获得)。由于erastin处理的细胞在长时间积累ROS后发生细胞死亡，并被抗氧化剂抑制，表明铁依赖的ROS积累是杀死这些细胞的原因。
由于两个Erastin靶标VDAC2和VDAC3驻留在线粒体中，我们推测Erastin诱导的死亡与线粒体电子传输链(ETC)产生的ROS异常有关。然而，在Erastin处理(10mM，6小时)的HT-1080细胞中，我们没有观察到MitoSOX敏感的线粒体ROS产生增加。ETC复合物I抑制剂鱼藤酮(250nM，6小时)促进了MitoSOX敏感ROS的产生，但对DFO不敏感。此外，KRAS突变的143B骨肉瘤细胞由于线粒体DNA(MtDNA)编码转录本(r0细胞)的耗尽而不能形成ETC依赖的ROS，对erastin和RSL3的敏感性与匹配的mtDNA野生型(r+)细胞一样敏感。因此，在人类癌细胞中，Erastin诱导的细胞死亡涉及DFO敏感的ROS积聚，并可发生在缺乏功能线粒体等的细胞中。（一般的氧化应激可能更加依赖线粒体功能，但是线粒体功能与铁死亡发生无关，所以，理论上在所有细胞中都可以诱导铁死亡的发生。）
我们检查了铁死亡是否与凋亡或坏死性死亡或自噬有形态、生物能量或其他相似之处。在透射电镜下，我们观察到，经erastin处理的HRAS突变体BJeLR工程肿瘤细胞没有表现出与星形孢子素(STS)诱导的凋亡(例如，染色质凝聚和边集)、过氧化氢(H2O2)诱导的坏死(例如，细胞质和细胞器肿胀、质膜破裂)或雷帕霉素诱导的自噬(例如，形成双膜包裹的囊泡)相关的特征形态学特征。经erastin处理的细胞中唯一独特的形态学特征是线粒体看起来比正常小，膜密度增加，这与我们以前的报告是一致的。
通过对细胞能量代谢来看，erastin，sts细胞内ATP与H2O2处理后完全不同，使用最近报道的调制图谱策略的变体，测试了12种已建立的小分子细胞死亡抑制剂在HT-1080细胞、BJeLR细胞和KRAS突变的CALU-1非小细胞肺癌细胞中预防铁死亡的能力。我们计算了每种抑制剂(按10点4倍稀释系列测试)对致死剂量的erastin(Me《0，死亡致敏；Me=0，无效；Me》0，死亡钝化)处理的细胞归一化活性的调节作用(Me《0，死亡致敏；Me=0，无效；Me》0，死亡钝化)。结果值以无人监督的方式分层聚类，并显示为热图。使用这种方法，我们观察到，erastin诱导的死亡并不一致地受到caspase、组织蛋白酶或calain蛋白酶(z-VAD-fmk、E64d或ALLN)、RIPK1(Necrostatin-1)、亲环素D(环孢素A)或溶酶体功能/自噬(bafilomycinA1、3-甲基腺嘌呤、氯喹)抑制剂的调节。
在HT-1080、BJeLR和CALU-1细胞中，DFO、抗氧化剂Trolox、MEK抑制剂U0126，以及较弱程度的蛋白质合成抑制剂放线菌亚胺(CHX)，都从Erastin诱导的死亡中挽救出来。在野生型和凋亡缺陷型Bax/Bak双基因敲除(DKO)小鼠胚胎成纤维细胞中，这些抑制剂也能有效地阻止Erastin诱导的铁死亡，表明铁死亡可以在人和小鼠来源的细胞中被激活，并且不依赖于Bax和Bak调控的核心凋亡机制。DFO、Trolox和U0126都可以阻止H2DCFDA敏感的ROS在经erastin处理的HT-1080细胞中积累，表明这些抑制剂在上游或在ROS产生的水平上起到了防止死亡的作用。由于Trolox、U0126和膜透性铁螯合剂2，2-联吡啶可以在erastin后6小时加入HT-1080细胞中，并且仍然可以提供实质性的死亡保护，因此铁死亡可能需要在很长一段时间内持续形成铁依赖的ROS才能触发死亡。（铁死亡时ROS积累的过程）
最后，在一项调制图谱实验中，测试了DFO、Trolox、U0126、CHX、膜透性铁螯合剂ciclopiroxolamine(CPX)和谷胱甘肽过氧化物酶模拟物ebselen(EBS)调节erastin、RSL3或其他16种被认为通过各种ROS依赖和ROS非依赖机制杀死细胞的机械上不同化合物的致命性的能力，我们观察到erastin和RSL3形成了一个与所有其他细胞死亡诱导剂分开的独特的簇。总之，这些数据支持这样的假设，即RSL诱导的铁死亡不同于凋亡、各种形式的坏死和自噬。
为了探索铁死亡的遗传基础，我们试图识别这一过程中唯一需要的基因。我们把重点放在线粒体的潜在作用上，因为这个细胞器在用erastin处理的细胞中表现出异常的形态。线粒体基因功能被针对1087个基因的定制arrayedshRNA文库干扰，其中大多数(901个，88%)编码预测的线粒体蛋白（高大上的技术）。利用这个文库，我们首先比较了erastin(7.3mM)诱导的铁死亡和STS(1MM)诱导的CALU-1细胞凋亡的遗传抑制能力。在所有5817个信息性发夹中，我们观察到那些从erastin诱导的铁死亡中拯救出来的shRNA和那些从STS诱导的凋亡中拯救出来的shRNA之间没有显著的相关性(Spearman秩和检验，r=0.01，p=0.46)，证实了不同的基因网络控制着erastin诱导的铁死亡和STS诱导的凋亡。
接下来，我们在HT-1080细胞中进行了第二次erastin抗性筛选，通过使用严格的确认管道，鉴定了六个高信度基因，每个基因至少有两个独立的shRNA支持，这些基因在HT-1080和CALU-1细胞中都是诱导铁死亡所必需的：核糖体蛋白L8(RPL8)、铁反应元件结合蛋白2(IREB2)、ATP合成酶F0复合亚单位C3(ATP5G3)、柠檬酸合成酶(CS)、四肽重复结构域35(TTC35)和酰辅酶A合成酶家族成员2(ACSF2)。与已建立的erastin诱导的铁死亡对CHX和DFO敏感的本质一致，RPL8是编码翻译所需的60S核糖体亚基的一个组成部分，而IREB2是编码铁代谢的主要调节因子。我们进一步验证了这些结果，表明shRNA介导的IREB2和IREB2负调控因子FBXL5的沉默导致了已知的铁吸收、代谢和储存基因TFRC、ISCU、FTH1和FTL的表达以及erastin敏感性的交互变化。这些结果为筛查和确认程序的质量提供了信心。为了建立这些结果在HT-1080和CALU-1细胞中的普适性，我们观察了这些基因在HT-1080、CALU-1和另外6个细胞株中的沉默效果。通过使用每个基因的最有效发夹(由HT-1080细胞中mRNA沉默水平定义)沉默这六个高置信度基因，通过细胞系组合可使79%(38/48)的shRNA获得R20%的挽救。因此，这些基因似乎是erastin诱导的铁死亡广泛需要的。接下来，我们测试了这些基因的沉默是否特定地减弱了erastin诱导的铁死亡，或者更广泛地调节了各种致死效应。沉默这六个基因可以防止Erastin诱导的铁死亡(6/6个发夹的R40%挽救)，但不能防止STS、鱼藤酮、雷帕霉素、蛋白酶体抑制剂MG132、DNA损伤剂喜树碱或Ca2+依赖的ATP酶抑制剂thapsigargin(0/6个发夹的R40%挽救)诱导的细胞死亡/细胞抑制。总而言之，这些数据支持这样一种假设，即与其他形式的细胞死亡相比，一个独特的遗传网络控制着erastin诱导的铁死亡。
ACSF2和CS都与线粒体脂肪酸代谢的调节有关，我们想知道这一过程是否会导致铁死亡。在癌细胞中，脂肪酸的合成部分依赖于谷氨酰胺(Gln)到α-酮戊二酸的代谢，这一过程可以被小分子转氨酶抑制剂氨基氧乙酸(AOA)抑制。在同时含有葡萄糖和谷氨酰胺的细胞培养液中，我们发现AOA(2MM)可以将HT-1080和BJeLR细胞从Erastin诱导的铁死亡中解救出来，类似于沉默CS和ACSF2的效果。在AOA处理的HT-1080细胞中，通过与α-酮戊二酸二甲酯(DMK)共同孵育恢复了erastin的致死性，DMK提供了下游代谢物，其从Gln的产生被AOA阻断。二氯乙酸(DCA)是一种不相关的线粒体功能调节剂，不会直接影响Gln代谢，但对Erastin诱导的铁死亡没有影响。这些结果表明，依赖于Gln、CS和ACSF2的脂质合成途径可以提供铁死亡所需的特定脂质前体。
我们最终的目的是研究体内铁死亡的潜在作用，因此我们试图找出一种有效和特异的药物样小分子抑制剂来抑制这一过程。为了克服许多单个小分子收藏的固有限制，我们组装了一个由9,517个小分子组成的自定义筛选文库，这些小分子来自3,372,615个商业可获得化合物的起始池，这些化合物根据药物的相似性、溶解性、支架多样性和其他参数在硅胶中过滤。对这个铅优化化合物(LOC)文库的筛选和随后的确认研究确定了一种化合物，我们将其命名为铁抑素-1(Fer-1)，它是对erastin诱导的HT-1080细胞(EC50=60nM)中铁死亡最有效的抑制剂。据我们所知，Fer-1的活性在任何生物系统中都没有报道。我们进行了Fer-1的全合成，并用这一材料证实了Fer-1的活性，并证明它特异性地抑制了RSL诱导的死亡，但不能抑制其他氧化致命化合物和凋亡诱导剂诱导的细胞死亡。接下来我们试图确定Fer-1的作用机制，Fer-1不抑制细胞外信号调节激酶(ERK)的磷酸化或阻止HT-1080细胞的增殖，这表明它不抑制MEK/ERK途径，不螯合铁，也不抑制蛋白质的合成。然而，FER-1确实阻止了Erastin诱导的胞浆和脂质ROS的积累。此外，与阳性对照抗氧化剂Trolox类似，Fer-1在无细胞条件下很容易氧化稳定的自由基2，2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)，这是内在抗氧化潜力的测试。用伯芳胺取代硝基(SRS8-24)或消除N-环己基(CA-1)破坏了Fer-1的抗氧化能力以及它防止erastin(10MM)诱导HT-1080细胞死亡的能力。因此，Fer-1需要这两种芳香胺来防止RSL诱导的死亡，这一功能似乎与其清除自由基的能力有关。我们的结果提示脂质ROS在Eastin诱导的死亡中起关键作用。因此，我们假设Fer-1是一种脂质活性氧清除剂，N-环己基部分在生物膜中起到亲脂性锚定的作用。与这一假设一致的是，在N-取代环状部分的碳数系统变化的一系列10个FeR-1类似物中，我们观察到预测的亲脂性(辛醇-水分配系数，logP)与每个分子的擦除死亡抑制能力之间存在显著的相关性(SpearmanR=0.85p=0.002)。在这些类似物中，我们观察到预测的亲脂性(辛醇-水分配系数，logP)与每个分子的erastin-死亡抑制能力之间存在显著的相关性(SpearmanR=0.85p=0.002)。值得注意的是，SRS8-72，一种Fer-1类似物，用N-环丙基代替N-环己基，在防止死亡方面比Fer-1弱一个数量级，但在无细胞DPPH试验中仍保持了同等的固有抗氧化能力，潜在的可能是促进Fer-1在脂质膜内的拴系，而不是影响该分子的内在抗氧化潜力。
有趣的是，仅靠脂质分配似乎不足以解释Fer-1的效力。FER-1具有类似的预测亲脂性，但比两种典型的亲脂性抗氧化剂(Trolox和丁基羟基甲苯)具有更强的erastin抑制效力，同时比两种代表性的可溶性抗氧化剂(TIron和Tempo)亲脂性和效力都要强得多。曲洛克斯和BHT都是酚类抗氧化剂，而Fer-1含有芳香胺。我们假设，这种差异可能赋予Fer-1一个独特的自由基反应性轮廓，使其更好地适应RSL机制。
在癫痫、中风和其他创伤情况下发生在神经系统中的激毒性细胞死亡被描述为一个氧化的、铁依赖的过程。我们推测神经死亡可能与erastin诱导的铁死亡有关。我们通过使用大鼠器官型海马切片培养(OHSC)模型验证了这一假设，该模型通过保留抑制性和兴奋性神经元连接及其支持细胞(包括星形胶质细胞和小胶质细胞)的完整性，与活体中的海马非常相似。OHSCs已被证明是铅化合物鉴定和验证的理想复杂制剂，能够预测体内疗效。OHSC用致命的兴奋性刺激(5mML-谷氨酸，3小时)治疗，模拟中风和神经退行性疾病的后果。这些切片与谷氨酸和溶剂单独孵育，或与谷氨酸+Fe1(2MM)、铁螯合剂CPX(5MM)或N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂MK-801(10MM)共同孵育。在谷氨酸治疗结束24小时后，我们分析了这些复合处理对作为细胞死亡指标的碘化丙啶(PI)摄取的影响，这些区域位于OHSCs的三个确定的区域：齿状回(DG)、CA1和CA3。双因素方差分析显示，脑区因素(F2，75=19.23，p《0.0001)和综合治疗因素(F4，75=67.8p《0.0001)均有显著性差异。着眼于复合治疗效果，Bonferroni后测表明，谷氨酸诱导了脑组织所有三个区域的显著细胞死亡，而与Fer-1、Cpx或MK-801联合处理后，这种死亡明显减弱，且程度几乎相同(P《0.001)，但DG内除谷氨酸+MK-801外，其他所有相互作用均显著减弱(图5B-5E)。这些结果表明，谷氨酸诱导的OHSCs死亡和Erastin诱导的癌细胞死亡具有共同的核心致死机制，可以被铁螯合或Fer-1抑制。
CPX和Fer-1抑制Erastin诱导的癌细胞死亡和谷氨酸诱导的OHSCs毒性，这与常见的铁和ROS依赖的死亡执行机制一致。我们想知道这两个过程是否也可以共享任何启动死亡的机制。谷氨酸诱导的脑细胞死亡可以通过离子型谷氨酸受体的钙内流和Na+非依赖性的胱氨酸/谷氨酸逆向转运体系统XCT。钙螯合剂BAPTA-AM、Fura-2和EGTA对Erastin诱导的死亡没有影响，排除Ca2+内流在这一过程中的作用。然而，我们观察到erastin和系统XCT的特异性抑制剂柳氮磺胺吡啶(SAS)的显著聚集。在HT-1080细胞中产生的19个氧化和非氧化致死分子的调控谱中。如果xct抑制可以引发铁死亡，然后通过另一种方式将这种代谢物提供给细胞，应该可以挽救死亡。b-巯基乙醇(b-ME)可以绕过XCT通过另一种途径促进胱氨酸摄取，强烈抑制由erastin、SAS和谷氨酸诱导的HT-1080细胞死亡。正如这些结果预测的那样，SAS和Erastin一样，表现为RSL化合物，尽管其效力比Erastin低得多,这仍然值得注意，因为SAS是FDA批准的药物，以前没有显示出这种活性。
XCT是一种由SLC7A11(XCT)和SLC3A2(4F2hc和CD98hc)组成的二硫键连接的杂二聚体。xct抑制可以导致SLC7A11的补偿性转录上调。与此一致，我们观察到在用erastin或SAS处理的HT-1080细胞中SLC7A11的显著上调，这一效应可被b-ME抑制，但不能被DFO或Fer-1抑制。带有两个独立的siRNA的siRNA介导的SLC7A11沉默使HT-1080细胞对Erastin诱导的死亡敏感，而将编码DDK标记的SLC7A11的质粒转染HT-1080细胞可保护HT-1080细胞免受erastin和SAS诱导的死亡。鉴于这些结果，我们直接检测了HT-1080细胞摄取胱氨酸的情况。Erastin(10MM)、谷氨酸(50MM)和SAS(1MM)可阻断Na+非依赖性摄取胱氨酸，而RSL3对此过程无影响。擦除蛋白是如何抑制XCT?亲和纯化数据的分析鉴定SLC7A5(LAT1，4F2lc和CD98lc)是在HRAS野生型BJeH和HRAS突变体BJeLR细胞的裂解物中被活性的erastin亲和类似物结合的唯一蛋白(图6G)。SLC7A5(和SLC7A11一样)是与SLC3A2结合形成不同底物选择性氨基酸转运蛋白的6条轻链之一。SLC7A5/SLC3A2复合体(系统L)运输大量的中性氨基酸。在用erastin(1mM，25分钟)处理的123种人JurkatT淋巴细胞代谢物的图谱中，观察到系统L底物水平非常显著的降低，而非系统L底物水平不变或增加。然而，与系统x的抑制不同的是，由于过量的谷氨酸(12.5mM)，使用过量的D-苯丙氨酸(12.5mM)抑制系统L(Kanai和Endou，2003)对erastin没有强烈的敏感性。总之，这表明erastin抑制系统L介导的氨基酸摄取，但这并不直接导致铁死亡。相反，erastin与SLC7A5或SLC7A5/SLC3A2复合物的结合可能干扰SLC3A2/SLC7A11复合物在反式中对胱氨酸的摄取。
XCT阻断抑制半胱氨酸依赖的谷胱甘肽(GSH)的合成，也抑制跨质膜半胱氨酸氧化还原穿梭，这两种作用都会损害细胞的抗氧化防御，从而促进有毒ROS的积累。在排除了线粒体等作为Erastin处理细胞中诱导死亡的ROS的来源后，我们检查了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)超氧化物产生酶(NOX1-5，DUOX1，2)家族的作用，该家族在几个RAS突变肿瘤中上调。典型的NOX抑制剂二苯基碘(DPI)、NOX1/4特异性抑制剂GKT137831和NADPH生成戊糖磷酸途径(PPP)的抑制剂6-氨基烟酰胺(6-AN)可强烈抑制Erastin诱导的CALU-1细胞铁死亡。在CALU-1细胞中，Erastin诱导的铁死亡被典型的NOX抑制剂DPI、NOX1/4特异性抑制剂GKT137831和NADPH生成戊糖磷酸途径的抑制剂6-氨基烟酰胺(6-AN)强烈抑制。鉴于CALU-1细胞表达NOX1的水平比NOX4高得多，NOX1最有可能在这些细胞中介导观察到的NOX依赖的致死效应。此外，shRNA介导的两种PPP酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)和磷酸甘油脱氢酶(PGD)的沉默，也可以与沉默VDAC2一样防止Erastin诱导的CALU-1细胞铁死亡。6-AN还可以阻止BJeLR细胞的死亡和ROS的产生，这表明这一途径在这些细胞类型中发挥了重要作用。另一方面，NOX和PPP抑制剂在防止erastin诱导的HT-1080细胞铁死亡方面只有部分效果(图7B)，这表明除了PPP/NOX途径之外，其他途径也可能对发病起作用。
本文结束，大佬的文章作为开山之作就是不一样，结合我看过的文献，基本上都没有超过这篇所讲述的范畴，看来考古确实比较重要，欢迎批评指正。

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